基于PrimerBank和NCBI数据库的引物查找与设计---生科三班xhs原创，请勿转载

一、引物数据库查找：

要设计一个mRNA的qPCR引物，首先应该先看看别人是否已经使用过，可以先在数据库PrimerBank中查找：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

1 首先我们要得到这个基因的Gene ID，我们在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中查找（以IL-1β为例）：

（1）在 “Gene” 下输入要查找的目的基因，点击‘Search’。

（2）找到IL-1β（注意物种对不对），点击紫色链接打开（最好右击在新标签页打开链接）。

（3）找到IL-1β的详细信息，IL-1β的Gene ID为3553。

2 打开PrimerBank网址：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

（4）按照下图将所需信息填入，点击submit。

（5）上图为submit后得到的结果，结果为Gene ID 3553的基因的详细信息，仔细再核对一遍；

（6）如下图所示，PrimerBank为我们找到的几条目的基因的qPCR引物，选择其中1-2条，并进行特异性验证。

3 再用NCBI 中的Primer-Blast检验引物的特异性。以查找到的第一条引物为例：

（7）打开https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/，将需要验证的上下游引物输入，调整参数如下图：

（8）其余参数保持不变。

（9）勾选Show results in a new window, 点击‘Get Primers’。

（10）得到验证结果如下图所示，再根据引物设计原则自行判断。

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二、NCBI Primer-Blast 引物设计：

（1）打开NCBI网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，在‘Gene’下搜索‘IL-1β’.

（2）找到如下所需目的基因，点击紫色链接进入（最好右击打开链接）。

（3）打开后得到IL-1β的详细信息，找到‘NCBI Reference Sequences (RefSeq)’下的‘mRNA and Protein(s)’，找到“NM_000576.2”（GeneBank Accession Number）。

（4）将“NM_000576.2”输入下面链接中的“PCR Template”。

Primer-Blast: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

（5）调整Primer Parameters入下图所示,

（6）勾选“Primer pair must be separated by at least one intron on the corresponding genomic DNA”，至少包含一个内含子，以避免样品基因DNA污染。

以上参数保持不变。

（7）勾选“show results in a new window”,点击“Get Primers”。

（8）等待运算，约3-5 min。

（9）运算结束得到结果，一般会默认给出前10条引物，根据引物设计原则自行选择。